GA NAAR INHOUDSOPGAVE
GA NAAR LITERATUUR A B C D E F G H I J K L M N O P R S T U V W Y Z
GA NAAR SAMENVATTING

HOOFDSTUK 7
DE (INDUSTRIËLE) PRODUCTIE VAN B12

7.1 Inleiding
Na de ontdekking van vitamine B12 in 1948 werd de stof aanvankelijk gewonnen uit de levers van koeien en varkens. Deze methode was echter duur en bovendien kon via deze methode al snel niet meer aan de groeiende vraag naar B12 worden voldaan. De meeste vitamines worden tegenwoordig langs chemische weg geproduceerd. Het synthetiseren van B12 langs chemische weg is echter erg ingewikkeld en vereist 70 afzonderlijke (reactie)stappen. Voor de productie van grote hoeveelheden is chemische productie daarom niet interessant. De tegenwoordig in gebruik zijnde B12-preparaten zijn alle afkomstig van microbiologische fermentatieprocessen. Hierbij worden in grote reactorvaten de optimale condities geschapen (qua temperatuur, medium, beluchting, enz.) voor micro-organismen die van nature B12 produceren. Na de fermentatie wordt de B12 aan de vloeistof onttrokken.

7.2 De markt
De productie is in handen van een aantal grote industriële bedrijven. De grootste bedrijven (+ adressen van de dichtstbijzijnde vertegenwoordiging) zijn: Farmitalia S.p.A. Italië-De Steiger 196, 1351 AV Almere; Glaxo Laboratories Ltd. Engeland-Wattbaan 51, 3439 ML Nieuwegein; Merck & Co., Inc. V.S.-Waarderweg 39, 2031 BN Haarlem; Rhône Poulenc S.A. Frankrijk-Draaistroom 1, 1181 VT Amstelveen; Rousell UCLAF Frankrijk Bijenvlucht 30, 3871 JJ Hoevelaken; G. Richter Pharmaceutical Co. Hongarije Gammel Kongevej 98, 1850 Frederiksberg C, Denemarken; en Chinoin Hongarije-P.O. Box 110, 1325 Budapest, Hongarije [Crueger 1984].
Na een lange concurrentiestrijd had Rhône Poulenc in 1985 60 tot 65 procent van de wereldproductie in handen. De wereldmarktprijzen zijn tussen 1951 en 1963 gedaald van 500 naar 15 dollar per gram. Sinds 1974 schommelt de prijs tussen de 6,00 en 1,80 dollar per gram. In totaal wordt per jaar zo'n 10.000 kg B12 geproduceerd. Hiervan is ongeveer 3.500 kg cyanocobalamine, 2.000 kg hydroxycobalamine en 1.000 kg adenosylcobalamine. De overige 3.500 kg gaat in de vorm van cyanocobalamine naar de veeteelt [Ward 1989]. Aan het veevoer van varkens en kippen (beiden geen herkauwers) wordt zo'n 10 tot 15 microgram per kilo voedsel toegevoegd [Ellenbogen 1991]. Voor veeboeren is dit economisch aantrekkelijk omdat ze door deze toevoeging niet genoodzaakt zijn om (dure) dierlijke eiwitten aan het voer toe te voegen en de dierverachtende bio-industrie (ligboxen en legbatterijen) gehandhaafd kan blijven.
De hoge consumptie van B12 door mensen is te verklaren uit het feit dat B12 niet uitsluitend wordt gebruikt om B12-tekorten te verhelpen. B12 is favoriet als placebo (vanwege de rode kleur), wordt veel gebruikt in de sportwereld (men denkt ten onrechte dat B12 het lichaam meer energie geeft en dat het kan bijdragen aan spierontwikkeling), en wordt toegepast in producten als zonnebrandolie, mondverfrissers, tandplakverwijderaars, anti-roos-middelen en anti-rimpelpreparaten.

7.3 De microbiologische productie van vitamine B12
7.3.1 Micro-organismen en grondstoffen
In de jaren 50 was de productie van B12 nog geen zelfstandig industrieel proces. De vitamine werd onttrokken aan vloeistoffen die overbleven van andere fermentatieprocessen waarbij toevallig ook B12 werd geproduceerd. Een van die fermentatieprocessen was de productie van antibiotica. Antibiotica worden geproduceerd door een groep micro-organismen genaamd Streptomyceten. Het medium bestond uit glucose en sojameel en de hoofdproducten waren streptomycis, chloramphenicol en neomycine. De B12-opbrengst was ongeveer 1 mg per liter medium. Ook werd B12 wel onttrokken aan brouwerij-afval en mest. De B12 die hiervan afkomstig was werd in ruwe en niet-volledig gezuiverde vorm gebruikt in veevoer. Ook werd de B12 afkomstig van deze bron geheel zuiver gemaakt zodat die geschikt was voor medisch gebruik, voor mensen. Een nadeel van B12 uit mest is dat zich hierin grote hoeveelheden analogen bevinden die niet eenvoudig (lees: niet goedkoop) van echte B12 zijn te scheiden. Ondanks het feit dat B12 werd gewonnen als bijproduct van de grootschalige antibioticaproductie (en andere fermentatieprocessen) kon al snel niet meer aan de vraag naar B12 voldaan worden [Perlman 1978]. Er is toen veel onderzoek gedaan naar alternatieve productiemogelijkheden. Doel was:

De meest gebruikte grondstoffen voor voedingsbodems zijn tegenwoordig glucose, sacharose, melasse, melkeiwitten, cornsteepliquor, sojameel en een hele reeks van minerale zouten en sporenelementen: kobalt in de vorm van kobaltnitraat of CoCl in een concentratie van 5 ppm, en verder o.a.: (NH4)2HPO4; MgSO4; KCl; MnSO4; FeSO4; ZnSO4; MoO4 [Daniels 1970].
Voor de productie van onzuivere B12-concentraten (lees: goedkope concentraten) voor de veeteelt wordt gebruik gemaakt van veel minder zuivere grondstoffen, zoals vismeel, melkwei, slachtafval [Perlman 1978], gistextracten, aardappelmeel, visafval, stikstofhoudende kunstmest, brouwerij-afval (mout), en mest [Crueger 1984]. Daarnaast kunnen bij de fermentatie dierlijke en plantaardige oliën worden gebruikt omdat deze een groeibevorderende en schuimremmende werking bezitten.
Tenslotte worden nog verschillende stoffen gebruikt om de zuurgraad constant te houden, o.a. ammoniumhydroxide. De samenstelling van het medium is voor iedere bacterie weer anders en verschilt ook per producent. De exacte samenstelling is fabrieksgeheim.

Er is veel onderzoek gedaan naar technieken om de vitamine uit het medium te isoleren en zuiver te maken. Het gaat immers om zeer kleine hoeveelheden, en welk medium of welke bacteriestam er ook wordt gebruikt, altijd worden er óók analogen gevormd.

Tegenwoordig zijn voor de productie van B12 aparte fermentatieprocessen in gebruik met speciaal voor dit doel geselecteerde en gekweekte bacteriën. De meest productieve bacteriestammen zijn mutanten. De mutaties kunnen spontaan zijn opgetreden maar worden ook kunstmatig opgewekt door de bacterie te bewerken met röntgenstralen of allerlei chemische stoffen. Ook wordt gewerkt met recombinant-DNA technieken [Köhler 1985].
Van de honderden fermentatieprocessen waarvan bekend is dat er B12 wordt geproduceerd, worden er maar een stuk of 6 commercieel toegepast. Enkele bacteriën met een relatief hoge opbrengst zijn: Bacillus megaterium (0,45 mg per ml); Butylbacterium rettgeri (5 mg per liter); Streptomyces olivaceus (3,3 mg per liter); Micromonospora sp. (11,5 mg per liter); en Klebsiella pneumoniae (0,2 mg per liter). De hoogste opbrengsten worden verkregen met Propionbacterium freudenreichii (19 mg per liter); Propionbacterium shermanii (23 mg per liter); en Pseudomonas denitrificans (60 mg per liter).
Pseudomonas en Propionbacterium groeien op melasse en hebben de allerhoogste opbrengst. Deze twee soorten worden tegenwoordig in de industrie het meest gebruikt. Het onderzoek staat echter niet stil. Er wordt gewerkt aan micro-organismen die op goedkopere voedingsbodems kunnen groeien, bijvoorbeeld op het afval van de voedingsmiddelenindustrie. Met Methanobacterium op fruitafval wordt bijvoorbeeld een opbrengst van 306 mg per kg bereikt. [Min 1990]. Ook wordt geprobeerd B12 uit methanol te produceren. In dat opzicht zou Protaminobacter ruber (220 microgram per liter) of Klebsiella (140 microgram per liter) in de toekomst een belangrijke rol kunnen gaan spelen [Rehm 1980]. Ook wordt de productie van B12 uit alkanen onderzocht (aardgas is een alkaan); in dat opzicht zou Corynebacterium simplex ( 0,6 mg per liter een rol kunnen gaan spelen [Rehm 1980]. Het aantal octrooi-aanvragen dat de laatste jaren voor deze nieuwe processen wordt ingediend is groot.

7.3.2 De fermentatie met Propionbacterium freudenreichii ATCC 6207 en Propionbacterium shermanii ATCC 13673 of hiervan afgeleide stammen of mutanten [Ward 1989]; [Crueger 1984]
De fermentatie verloopt in twee fasen. In de eerste anaërobe fase van twee dagen wordt voornamelijk een voorloper van B12, dimehylbenzimidazole (DBI) geproduceerd, die in de tweede aërobe fase van vier dagen wordt omgezet in B12, voornamelijk adenosylcobalamine. Er worden slechts zeer kleine hoeveelheden analogen gevormd. De koolstofbron van de voedingsbodem is glucose of omgezette melasse (10 - 100 gram per liter). Als stikstofbron worden gistextracten en caseïne (het voornaamste eiwit in melk) gebruikt; de laatste in een toevoeging van 1,2 procent [Rehm 1980]. De voorkeur gaat echter ook uit naar corn steep liquor (een bijproduct van de zetmeelproductie uit maïs) omdat dit ook melkzuur en pantotheenzuur (B5) bevat. Deze vitamine wordt echter ook wel los toegevoegd. De productiviteit kan nog worden verhoogd door toevoeging van melksuiker (een disaccharide in melk-dit wordt toegevoegd in een concentratie van maximaal 40 gram per liter), en ook wordt wel gebruik gemaakt van wei [Marwaha 1984]. Daarnaast worden nog vele sporenelementen en minerale zouten toegevoegd: ijzer-, mangaan-, kobalt- en magnesiumzouten. De koolstof- en stikstofbronnen kunnen ook worden vervangen door afgeroomde melk. De totale opbrengst zou 25 tot 40 mg per liter zijn na 6 dagen fermentatie. Waarschijnlijk is de opbrengst nog hoger. In één patent [Ward 1989] wordt melding gemaakt van een opbrengst van 216 mg per liter.

7.3.3 Fermentatie met Pseudomonas [Ward 1989]; [Crueger 1984]
Van de Pseudomonas bacteriën is de Pseudomonas denitrificans de meest productieve. Na twaalf jaar sleutelen aan deze bacterie zijn mutanten ontwikkeld met een opbrengst van 60 mg per liter. Het productieproces met deze bacterie is geheel aëroob. Aan het medium worden minder hoge eisen gesteld en het kan veganistisch worden samengesteld: sucrose, gistextract, en verschillende minerale zouten, waaronder kobaltnitraat. Ook moet dimehylbenzimidazole (DBI-een stof die uit riboflavine (= vitamine B2) gesynthetiseerd wordt) worden toegevoegd. Een gunstige werking heeft de toevoeging van betaïne, een stof die gewonnen wordt uit suikerbieten [Demain 1968]. Deze stof bevordert de biosynthese van B12 en verhoogt de doorlaatbaarheid van het celmembraan. Hierdoor kan de cel zijn of haar stofwisselingsproducten gemakkelijker kwijt. Betaïne is bovendien een koolstofbron. Verder moet nog choline worden toegevoegd. Dit kan zowel van plantaardige als dierlijke oorsprong zijn.

7.4 Extractie van B12
Na de fermentatie moet de B12 uit het medium gehaald worden en worden gezuiverd. Ondanks de vorderingen die op dat gebied zijn gemaakt blijft het een moeizaam proces. Er bestaan meerdere methoden, bijvoorbeeld het centrifugeren van het medium waardoor een soort crème van cellen overblijft die gedroogd wordt en een B12-concentratie heeft van 385 mg per kg en in ongezuiverde vorm in veevoeders gebruikt wordt (met propionibacterium Perlman 1978]). Een andere methode is scheiding met behulp van ionenwisselaars, waarna kristallisatie volgt. Ten behoeve van het extractieproces wordt de gehele kweek op 80 tot 120 graden Celsius gebracht bij een pH van 6,5 tot 8,5. De cobalaminen worden eerst stabiel gemaakt door ze om te zetten in cyano-, sulfiet-, sulfaat-, nitraat- of chloorcobalamine. Daarna volgt extractie waarvoor meerdere technieken bestaan:

Ook wanneer het de bedoeling is hydroxycobalamine, methylcobalamine of desoxyadenosylcobalamine te produceren, wordt de B12, om beschadigingen te voorkomen, vóór extractie eerst omgezet in een stabielere vorm van vitamine B12. Na extractie worden deze vervolgens via chemische weg weer omgezet in de gewenste vorm. De productie van de beide co-enzymen is alleen mogelijk in koele en donkere omstandigheden. Bovendien is het belangrijk dat de pH constant blijft [Ward 1989].

7.5 Productie van plantaardige B12-bevattende voedingsmiddelen
Omdat steeds meer mensen vegetarisch worden, wordt er aan de afdeling Levensmiddelentechnologie en Gistingsprocessen van de Technische Universiteit van Berlijn onderzoek gedaan naar het combineren van de bacteriële productie van B12 met de (industriële) productie van voedingsmiddelen als sojamelk en tofu [Bärwald 1991]. Onderdeel van het onderzoek is het vinden van geschikte B12-producerende bacteriën die in staat zijn om gedurende een (extra) ingelaste fermentatiefase in het product B12 te produceren. Hierbij zijn verschillende dingen van belang: de hoeveelheid B12 die door de bacterie wordt geproduceerd, de nevenproductie van schadelijke stoffen die uiteraard achterwege dient te blijven, veranderingen in smaak en consistentie veroorzaakt door het micro-organisme die tot een minimum beperkt moeten blijven, en de inpasbaarheid in het productieproces die voor een groot deel wordt bepaald door de fermentatieduur. De twee bacteriën die zich voor de B12-productie in sojamelk het beste lijken te lenen zijn Bacillus megaterium (ATTC 10778) en Propionibacterium freudenreichii subspec. (ATTC 6207). De pseudomonaden zijn minder geschikt omdat deze de melk al bij lage concentraties ( 106 bacteriën/ml) onprettig doen ruiken en smaken. B. Megaterium veroorzaakt in de melk een kazige lucht en kan ook door het vormen van zuren tot klontering van de melk leiden. De fermentatie duurt 24 uur bij 30 graden Celsius, en er is dan een B12-concentratie van 5,2 microgram per 100 gram bereikt.
Ook Propionibacterium freudenreichii subspec. veroorzaakt een kazige lucht (als van emmentalerkaas). De productie van B12 met deze bacterie is nogal bewerkelijk omdat de fermentatie in 2 fasen van ieder 72 uur moet worden uitgevoerd. Er kan echter een B12-concentratie van 45,3 microgram per 100 gram worden bereikt.
De bacteriën worden geënt nadat de sojamelk is gepasteuriseerd; de fermentatie wordt afgebroken door de sojamelk te steriliseren. De B12-productie kan worden opgevoerd door kobalt toe te voegen. Na toevoeging van kobalt in een concentratie van 1,24 ppm loopt de B12-concentratie bij B. megaterium op van 5,2 naar 13,5 microgram per 100 gram en bij Propionibacterium freudenreichii subspec. van 45,3 naar 80 microgram per 100 gram. Bovendien kan door toevoegen van kobalt bij Propionibacterium freudenreichiisubspec. de fermentatieduur bekort worden. De B12-productie met B. megaterium kan nog worden gestimuleerd door het toevoegen van verteerbare koolhydraten.
Het maken van tofu van sojamelk die op bovenstaande wijze met B12 is verrijkt kan problemen geven. De eiwitten ondergaan tijdens de fermentatie een verandering waardoor de tofu zacht blijft. Door de duur van de fermentatie te bekorten is hier echter iets aan te doen. Twintig procent van de B12 gaat bij het maken van tofu verloren in het spoelwater. Tachtig procent van de B12 blijft gebonden aan de eiwitten en blijft in de tofu.
Om het eindproduct het gewenste B12-gehalte te geven kan B12-bevattende sojamelk worden vermengd met B12-loze sojamelk. In Nederland is het verboden om B12 aan voedingsmiddelen toe te voegen. Door bovenstaande ontwikkeling wordt het misschien mogelijk om toch B12-bevattende sojamelk in de winkels te krijgen. Helaas bevindt de ontwikkeling zich nog in een experimentele fase. Het fermentatieproces van tempeh duurt veel korter dan het fermentatieproces bij de productie van B12 met bovenstaande bacteriën. Onder andere hierdoor zijn bovenstaande technieken ongeschikt voor het verrijken van tempeh met B12 [Bärwald 1991].


GA NAAR INHOUDSOPGAVE
GA NAAR LITERATUUR A B C D E F G H I J K L M N O P R S T U V W Y Z
GA NAAR SAMENVATTING