HOOFDSTUK 3
HET VASTSTELLEN VAN B12-CONCENTRATIES
3.1 Inleiding
Corronoïden komen in zeer kleine hoeveelheden voor. Dat maakt
het bepalen van de concentraties niet eenvoudig. Het gebruik van de verschillende
methoden levert vaak verschillende uitkomsten op, waardoor er nogal eens
misverstanden zijn ontstaan. Vaak was niet duidelijk of alleen cobalaminen
of ook andere corronoïden werden gemeten. Met wat kennis over de meettechnieken
kunnen berichten over B12-gehalten in plantaardige voedingsmiddelen beter
op hun waarde worden geschat.
3.2 Extractie
Om de cobalamine-concentratie (in bijvoorbeeld voedsel) te kunnen bepalen
is het op de eerste plaats nodig de vitamine los te maken van de eiwitten
waaraan deze vaak is gebonden. Hiervoor wordt onder andere zoutzuur, zwavelzuur
of natronloog gebruikt. Ook wordt wel met plantaardige enzymen gewerkt
(bijvoorbeeld papaïne). Na dit losmaken wordt van organische oplosmiddelen
gebruik gemaakt (bijvoorbeeld phenol of benzyl-alcohol) om de vitamine
uit te spoelen. Daarna volgt de extractie van de B12 uit het oplosmiddel.
Hierbij wordt wel gebruik gemaakt van ether of van ionenwisselaars. Omdat
corronoïden allen goed oplosbaar zijn in water is het mogelijk ze
vervolgens met water uit te spoelen. Het grote gevaar is steeds dat door
de bewerkingen een deel van de B12 verloren gaat, wat foutieve meetresultaten
tot gevolg heeft. Bij de aanwezigheid van slechts een klein beetje cyanide
gaan bovendien vele cobalaminen over in de meer stabiele cyanidevorm. Aangezien
dit nog steeds een cobalamine is, is dat alleen een nadeel als je de concentraties
van de afzonderlijke cobalaminen wilt bepalen. Het overgaan van de cobalaminen
in de stabiele cyanidevorm treedt zo gemakkelijk en zo snel op dat men
aanvankelijk niet door had dat het gebeurde. Het eerste kristalzuivere
vitamine B12 was cyanocobalamine en men dacht dat dit de enige en natuurlijke
B12 was. Het heeft een jaar geduurd voordat men er achter kwam dat cyanocobalamine
een kunstmatige vorm van B12 is, die ontstaat tijdens een extractieproces
waarbij gebruik wordt gemaakt van cyanide-houdende koolstof.
3.3 Scheiding
Corronoïden die afkomstig zijn van micro-organismen bevatten naast
cobalaminen ook allerlei non-cobalamine-corronoïden en/of incomplete
corronoïden. Om niet (alleen) het totaal aan corronoïden te meten
maar (ook) dat van de verschillende fracties, is het in bepaalde gevallen
nodig die fracties eerst van elkaar te scheiden. Het scheiden van corronoïden
afkomstig van mensen en andere gewervelde dieren is vaak niet nodig, omdat
je van deze corronoïden al weet dat het voornamelijk cobalaminen zijn.
3.3.1 Papierchromatografie
Eén scheidingstechniek is de papierchromatografie. Hierbij worden
de corronoïden in een speciale oplossing op strippen papier gebracht.
De verschillen in molecuulgrootte bepalen de snelheid waarmee de verschillende
corronoïden door het papier trekken. Hierdoor ontstaat scheiding van
de verschillende fracties. De scheiding wordt zichtbaar door het ontstaan
van subtiele rode en gele kleurverschilllen. Een snelle variant van deze
techniek heet dunnelaagchromatografie.
3.3.2 Ionophorese
Een andere techniek is de ionophorese. Het is een zelfde techniek als
papierchromatografie, met dat verschil dat het papier bij deze techniek
onder stroom staat. De elektrische stroom doet de verschillende fracties
door het papier lopen, richting elektrodes. Niet alleen de grootte van
de moleculen speelt nu een rol, maar ook hoe zuur of basisch het corronoïde
is. Wat ook toegepast wordt is een combinatie van papierchromatografie
en ionophorese [Gray 1959]. Bijvoorbeeld eerst
scheiden met papierchromatografie en daarna op hetzelfde stuk papier, maar
onder een hoek van 90 graden, ionophorese. Hierdoor is het mogelijk het
gedrag van de afzonderlijke componenten nader te bestuderen.
(Naast scheiding is het via deze technieken overigens ook mogelijk
om de corronoïden kwantitatief te bepalen. Dit door een vergelijk
te maken met de loopsnelheid van parallelproeven met oplossingen waarvan
de B12-concentratie bekend is. Een andere manier waarmee hoeveelheden kunnen
worden gemeten is het in stukken knippen van het papier in bijvoorbeeld
stukjes van 1 cm2 en van ieder afzonderlijk stukje de corronoïden
eruit te stomen en de hoeveelheid via de microbiologische methode vast
te stellen (zie 3.4.1.1).)
3.3.3 Andere scheidingsmethoden
Andere scheidingsmethoden zijn onder andere kolomchromatografie en
de koolstofadsorptie-techniek. Daarnaast zijn er technieken die gebruik
maken van B12-specifieke bindingseiwitten die door de maag en de speekselklieren
worden afgescheiden: intrinsieke factor en R-binder, vaak afkomstig van
varkens (zie 3.4.2.1). Deze laatste scheidingstechnieken
zijn dus niet veganistisch. Tenslotte is er nog de hogedrukvloeistofchromatografie.
Deze methode is geschikt om snel ME-CBL, ADO-CBL, OH-CBL en CN-CBL van
elkaar te scheiden.
3.4 De biologische en niet-biologische B12-bepaling
Na scheiding is het mogelijk om hoeveelheden te gaan bepalen. Ook hiervoor
bestaan verschillende technieken.
3.4.1 De biologische tests
3.4.1.1 De microbiologische tests
Bij de microbiologische methode worden micro-organismen gebruikt die
absoluut corronoïden nodig hebben voor de groei. Een aantal van deze
microbiologische methodes zijn de meest specifieke en meest gevoelige van
alle B12-meettechnieken en deze worden daarom veel gebruikt voor farmaceutische
doeleinden. Een van de werkwijzen gaat als volgt: op papieren schijfjes
worden de te meten corronoïden aangebracht. Vervolgens wordt het schijfje
overgoten met vloeibare agar agar (een voedingsbodem voor micro-organismen
gemaakt van zeewier) waaraan geselecteerde micro-organismen zijn toegevoegd.
De mate waarin de micro-organismen tot ontwikkeling komen kan worden gemeten
met fotometrische opname-apparatuur en dit kan worden vergeleken met standaardproeven.
De hoeveelheid corronoïden kan nu worden berekend. Dezelfde techniek
kan ook gebruikt worden op de papieren strippen waarmee papierchromatografie
of ionophorese is gedaan. Door het gebruik van een mengsel van verschillende
soorten micro-organismen die ieder op zich, specifiek zijn voor slechts
één bepaald deel van de corronoïden, kunnen de fracties
op de strippen zichtbaar worden gemaakt. Deze techniek heet bio-autografie.
Het combineren van deze twee technieken, de papierchromatografie en de
microbiologische test, is de enige methode waarmee individuele cobalaminen
uit bijvoorbeeld bloedplasma of voedsel van elkaar zijn te onderscheiden
en waarbij de afzonderlijke hoeveelheden exact zijn te meten.
Het maakt veel uit welk soort micro-organisme er gebruikt wordt. Een
van de eerste microbiologische tests werd gedaan met Lactobacillus lactus
Dorner. Deze bleek later weinig specifiek te zijn. Van de vele geteste
soorten zijn er vier soorten die het meest worden toegepast. Twee bacteriën:
Lactobacillus leichmannii en Escherichia coli, en twee protozoa:
Ochromonas malhamensis en Euglena gracilis.
Escherichia coli groeit op cobalaminen én op alle analogen en wordt gebruikt bij het vaststellen van het totaal aan analogen + B12.
Lactobacillus leichmannii: de warenwet in de Verenigde Staten (de FDA) schrijft voor dat bij het vaststellen van het vitamine-gehalte in voedselgebruik moet worden gemaakt van Lactobacillus leichmannii. Deze bacterie groeit echter ook op een aantal non-cobalamine-corronoïden, waardoor veel misverstanden over B12-gehalten zijn ontstaan [Hoffmann 1949]. De meetresultaten zijn vaak geïnterpreteerd alsof het bij metingen met Lactobacillus leichmannii zou gaan om het totaal aan voor mensen werkzame B12. In werkelijkheid kan echter veel minder of zelfs helemaal geen B12 aanwezig is. Sommige fabrikanten verschuilen zich achter de wettelijke status van Lactobacillus leichmannii wanneer het B12-gehalte in bepaalde producten wordt aangevochten. (Voor nog andere redenen waarom juist Lactobacillus leichmannii wettelijk is voorgeschreven zie 4.8).
Euglena gracilis is erg gevoelig en geeft al respons bij B12-concentraties die tienmaal kleiner zijn dan nodig is voor een respons bij Lactobacillus leichmannii. Maar ook Euglena gracilis kan nog steeds op een aantal analogen groeien.
Ochromonas malhamensis is het meest specifiek voor cobalaminen. Deze heeft een B12-huishouding die het meest lijkt op die van mensen (en andere gewervelde dieren) en groeit uitsluitend op cobalaminen. Waarom niet uitsluitend van dit laatste eencellige wiertje gebruik gemaakt wordt bij het bepalen van echte B12 is niet duidelijk. Waar het mee te maken kan hebben is dat Ochromonas malhamensis (en Euglena gracilis) een veel langere incubatietijd heeft dan Lactobacillus leichmannii en dat de test met Ochromonas malhamensis bovendien veel bewerkelijker is [Documenta Geigy 1962] [Ford 1953]. De incubatietijd van Lactobacillus leichmannii is 16 tot 24 uur, terwijl die van Ochromonas malhamensis 3 tot 7 dagen is.
Een nadeel van de microbiologische methode is dat het gestandaardiseerd
vervaardigen van de entcultuur van het testorganisme nog steeds niet goed
mogelijk is. Daardoor moet om nauwkeurig te kunnen werken bij iedere proef
een parallelproef draaien met een standaard hoeveelheid B12. Om dezelfde
reden is het ook moeilijk om een standaardcurve te reproduceren [Zuivelbureau
1981].
Een ander nadeel is dat bij het meten van B12-concentraties in het
bloed met de microbiologische methode te lage uitkomsten kunnen worden
verkregen wanneer de te onderzoeken persoon antibiotica gebruikt [Clementz
1990].
3.4.1.2 Andere biologische tests
Andere biologische tests zijn de onveganistische methoden met kippen,
muizen en ratten. De methode met kippen wordt duur en onhandig gevonden
maar schijnt betere resultaten te hebben dan de hierboven beschreven methoden,
omdat kippen dichter bij mensen staan dan micro-organismen. De kippen worden
gevangen gehouden en mishandeld door ze op een dieet te zetten waarin B12
ontbreekt. Vervolgens wordt na toediening van de te bepalen hoeveelheid
cobalaminen de groeirespons gemeten. Ook met ratten en biggetjes worden
op die manier testen uitgevoerd. Sinds enkele jaren bestaat er een speciaal
voor dit doel gekweekt soort dwergvarkens, waarmee men hoopt wetenschappelijke
onderzoekingen gemakkelijker te kunnen blijven uitvoeren. (Bah!)
Dierproeven in verband met B12 hebben overigens een beperkte waarde
(zoals veel dierproeven) omdat B12-gebrek bij dieren niet dezelfde afwijkingen
veroorzaken als bij mensen. Bij mensen leidt B12-gebrek voornamelijk tot
afwijkingen aan het bloed en het zenuwstelsel. Vitamine B12-gebrek bij
dieren is voornamelijk van invloed op de groei (vandaar die tests), het
veroorzaakt bij hen verder gewichtsverlies, verlies van eetlust en onvruchtbaarheid.
3.4.2 De niet-biologische tests
3.4.2.1 De competitieve eiwitbinding
Deze test is met name geschikt voor de bepaling van de B12-concentratie
in het bloed. De algemeen in gebruik zijnde B12-tests voor bloedserum zijn
allen van deze methode afgeleid. De test wordt ook wel radio-isotopische
verdunnings- en bindingsmethode genoemd. In het Engels: radio isotope dillution
assay-afgekort: RIDA.
In dit boek wordt de test aangeduid met CPB, dit is de afkorting van
de Engelstalige benaming: competitive-protein-binding(assay).
De CPB-test is eenvoudig en snel in het gebruik. Er kunnen zeer lage
concentraties B12 mee worden gemeten en het monster dat minimaal nodig
is om een meting te kunnen verrichten kan zeer klein zijn (200 microliter
= 0,2 cm3). De gevoeligheid benadert de micro-biologische test en wordt
niet negatief beïnvloed door antibiotica. De werking is als volgt:
een mengsel van de te meten hoeveelheid corronoïden en een bekende
hoeveelheid radioactief (!) gemerkt B12 (waarvan het kobaltatoom in de
'corrin' een radioactief isotoop van kobalt is) wordt vermengd met een
beperkte hoeveelheid eiwit (intrinsieke factor) dat de eigenschap heeft
B12 aan zich te binden. De beide soorten B12-moleculen raken gebonden aan
het eiwit en deze gebonden moleculen kunnen aan het mengsel worden onttrokken.
Vervolgens wordt van deze gebonden moleculen de verhouding radioactief
en niet-radioactief B12 bepaald door het meten van de hoeveelheid radioactiviteit.
Uit de verhouding tussen radioactief en niet-radioactief gebonden B12 is
de oorspronkelijke hoeveelheid B12 in het monster te berekenen en ook kan
deze hoeveelheid worden afgelezen van een standaard curve.
De verbeterde CPB-test: de CPB-methode was oorspronkelijk niet zuiver;
er werden ook analogen gemeten [Kolhouse 1978];
[Cooper 1978]. In de loop van de tijd is de
methode sterk verbeterd door de monsters vooraf in verschillende fracties
te scheiden (analogen en niet-analogen) [Herbert
1988b]. Hiervoor wordt een combinatie van intrinsieke factor en R-binder
gebruikt. Beide zijn eiwitten die in het lichaam van mensen geproduceerd
worden en daar actief zijn bij het B12-transport (zie 6.1.3
- cobalophiline). Voor laboratoriumgebruik worden deze uit onder andere
de magen van varkens en uit het bloed van kippen gewonnen [Zagalak
1979]. Vanaf 1981 is deze verbeterde methode algemeen in gebruik geraakt.
Bij de verbeterde CPB-assay wordt vooraf met R-binder de totale hoeveelheid
corronoïden gebonden en aan de oplossing onttrokken. Met (gezuiverde)
intrinsieke factor, die zich alleen aan B12 bindt, worden vervolgens de
cobalaminen gebonden. Na te zijn losgemaakt van de intrinsieke factor kunnen
de hoeveelheden vervolgens met CPB worden bepaald. De hoeveelheid analogen
kan worden berekend door de cobalaminen van het totaal aan corronoïden
af te trekken. De verbeterde versie wordt daarom (in het Engels) differential-radio-assay
genoemd. In het Nederlands: verbeterde competitieve eiwitbindings-methode,
en in dit boek aangeduid met 'verbeterde CPB'. Een foutieve naam, die vaak
wordt gebruikt, is radio-immuno-assay oftewel radioactieve-immuunstof-meettechniek.
Deze fout is ontstaan doordat deze test is afgeleid van een methode om
insuline te meten. Daarbij werd gebruik gemaakt van insuline-anti-lichamen
als binder. Omdat deze methode zo'n belangrijke uitvinding was (er is een
Nobelprijs voor uitgereikt) [Herbert 1987a]
is die naam bij velen blijven hangen.
Een variant van de verbeterde CPB test die gebruikt wordt bij de bepaling
van de B12-concentratie in het bloed is een test waarbij de intrinsieke
factor is gebonden aan polyacrylamide waardoor de gebonden IF eenvoudig
door middel van centrifugeren van het mengsel is te scheiden [Friedrich
1988]. Ook is er een methode waarbij het IF is gebonden aan magnetische
deeltjes en waarbij de standaard toegevoegde B12 niet radioactief maar
met acridinium-ester (AE) is gemerkt. Na de reactie, waarbij zowel deze
gemerkte B12 als de B12 uit het bloed aan intrinsieke factor gebonden raakt,
wordt de intrinsieke factor via magnetische weg uit de oplossing gehaald.
Door toevoeging van twee andere stoffen ontstaat een lichtgevende chemische
reactie. De hoeveelheid licht kan worden gemeten, waarna de B12-concentratie
van het (bloed)monster kan worden berekend. De B12 uit het bloed wordt
in deze test met NaOH van de eiwitten losgemaakt. Om te voorkomen dat de
B12 zich opnieuw aan de eiwitten bindt, wanneer de zuurgraad tijdens de
test terugloopt, wordt cobinamide toegevoegd, een corronoïde. Ook
deze test is niet veganistisch; er wordt intrinsieke factor uit varkensmagen
gebruikt. Daarnaast worden ook menselijke bloedproducten (albumine) gebruikt.
Een merknaam van een testset op basis van dit principe is 'Magic Lite'
[Magic Lite].
Tenslotte is er een B12-test waarbij met een gesplitst enzym wordt
gewerkt (en die verder is gebaseerd op het principe van competitieve eiwitbinding
en waarbij geen gebruik gemaakt wordt van radio-actieve stoffen). De methode
heet: cloned enzyme donor immuno-assay (CEDIA). Door middel van een DNA-recombinant
techniek wordt vooraf het enzym, beta-galactosidase, gesplitst in twee
fragmenten. Wanneer deze twee fragmenten bij elkaar komen vormen ze een
actief enzym. De ene helft van het enzym wordt een enzymdonor genoemd en
de andere helft wordt een enzym-acceptor genoemd. In plaats van een competitieve
eiwitbinding tussen normaal en radio-actief B12, vindt de competitieve
eiwitbinding in deze test plaats tussen B12 en de enzymdonor. Ook bij deze
test wordt als bindingseiwit intrinsieke factor gebruikt. Naarmate er meer
B12 is wordt er meer enzym gevormd. De detectiegrens van deze test is 12,3
picomol per liter. De test is nauwkeurig, werkt zonder radio-actief materiaal
en is eenvoudig en snel uit te voeren. De test is niet bruikbaar bij patiënten
die lijden aan myeloma (beenmergtumor). De test is ook bruikbaar voor het
meten van foliumzuur. In dat geval wordt geen intrinsieke factor gebruikt,
maar een foliumzuur-bindingseiwit dat uit de melk van runderen wordt gewonnen
[Weide 1992].
3.4.2.2 De enzymatische test
Bij deze test wordt gebruik gemaakt van de eigenschappen van cobalaminen
om te reageren met apo-enzymen. Er wordt onder andere gebruik gemaakt van
het apo-enzym glyseroldehydratase. Dit wordt gewonnen uit het micro-organisme
Klebsiella pneumoniae. De test kan onderscheid maken tussen enzymatische
en niet-enzymatische cobalaminen.
3.4.2.3 De spectroscopische test
Een makkelijk uit te voeren test. Deze test maakt geen onderscheid
tussen de verschillende corronoïden en is dus alleen geschikt voor
het meten van het totaal aan corronoïden.
3.4.2.4 De neutron-activerings test
Een dure test gebaseerd op het bestralen van B12 met neutronen. Het
in zeer kleine hoeveelheden van nature voorkomende radioactieve 59Co verandert
hierdoor in het radioactieve 60Co. De hoeveelheid B12 van het monster is
te berekenen wanneer die wordt vergeleken met een standaardtest.
3.4.2.5 Gas-chromatografie
Een test waarbij het te meten monster in gasvormige toestand in een
gas-chromatograaf wordt gebracht, waar de moleculen vervolgens door een
sterk elektrisch veld tegen een afleesplaat worden geslingerd. Door vergelijking
met standaarden is de B12-concentratie te bepalen. Tegelijkertijd met het
meten van de B12-concentratie treedt scheiding op van de verschillende
fracties. Omdat de molecuulgewichten niet heel sterk van elkaar verschillen
zijn de resultaten wat dit laatste betreft niet altijd optimaal.
3.4.2.6 Chemische bepaling
Verschillende methoden zijn mogelijk, de meeste zijn gebaseerd op chemische
reacties met delen van het B12-molecuul. De reactieproducten kunnen vervolgens
worden gemeten door middel van gas-chromatografie.
1-ME-CBL en andere methylcorronoïden reageren met kwikchloride.
Het methylkwikchloride dat ontstaat kan door middel van gas-chromatografie
in picogrammen nauwkeurig worden bepaald.
2-Na het chemisch uiteenvallen van B12 kan het anorganische kobalt
in microgrammen nauwkeurig worden bepaald.