7.1 Inleiding
Na de ontdekking van vitamine B12 in 1948 werd de stof aanvankelijk
gewonnen uit de levers van koeien en varkens. Deze methode was echter duur
en bovendien kon via deze methode al snel niet meer aan de groeiende vraag
naar B12 worden voldaan. De meeste vitamines worden tegenwoordig langs
chemische weg geproduceerd. Het synthetiseren van B12 langs chemische weg
is echter erg ingewikkeld en vereist 70 afzonderlijke (reactie)stappen.
Voor de productie van grote hoeveelheden is chemische productie daarom
niet interessant. De tegenwoordig in gebruik zijnde B12-preparaten zijn
alle afkomstig van microbiologische fermentatieprocessen. Hierbij worden
in grote reactorvaten de optimale condities geschapen (qua temperatuur,
medium, beluchting, enz.) voor micro-organismen die van nature B12 produceren.
Na de fermentatie wordt de B12 aan de vloeistof onttrokken.
7.2 De markt
De productie is in handen van een aantal grote industriële bedrijven.
De grootste bedrijven (+ adressen van de dichtstbijzijnde vertegenwoordiging)
zijn: Farmitalia S.p.A. Italië-De Steiger 196, 1351 AV Almere; Glaxo
Laboratories Ltd. Engeland-Wattbaan 51, 3439 ML Nieuwegein; Merck &
Co., Inc. V.S.-Waarderweg 39, 2031 BN Haarlem; Rhône Poulenc S.A.
Frankrijk-Draaistroom 1, 1181 VT Amstelveen; Rousell UCLAF Frankrijk Bijenvlucht
30, 3871 JJ Hoevelaken; G. Richter Pharmaceutical Co. Hongarije Gammel
Kongevej 98, 1850 Frederiksberg C, Denemarken; en Chinoin Hongarije-P.O.
Box 110, 1325 Budapest, Hongarije [Crueger 1984].
Na een lange concurrentiestrijd had Rhône Poulenc in 1985 60
tot 65 procent van de wereldproductie in handen. De wereldmarktprijzen
zijn tussen 1951 en 1963 gedaald van 500 naar 15 dollar per gram. Sinds
1974 schommelt de prijs tussen de 6,00 en 1,80 dollar per gram. In totaal
wordt per jaar zo'n 10.000 kg B12 geproduceerd. Hiervan is ongeveer 3.500
kg cyanocobalamine, 2.000 kg hydroxycobalamine en 1.000 kg adenosylcobalamine.
De overige 3.500 kg gaat in de vorm van cyanocobalamine naar de veeteelt
[Ward 1989]. Aan het veevoer van varkens en
kippen (beiden geen herkauwers) wordt zo'n 10 tot 15 microgram per kilo
voedsel toegevoegd [Ellenbogen 1991]. Voor veeboeren
is dit economisch aantrekkelijk omdat ze door deze toevoeging niet genoodzaakt
zijn om (dure) dierlijke eiwitten aan het voer toe te voegen en de dierverachtende
bio-industrie (ligboxen en legbatterijen) gehandhaafd kan blijven.
De hoge consumptie van B12 door mensen is te verklaren uit het feit
dat B12 niet uitsluitend wordt gebruikt om B12-tekorten te verhelpen. B12
is favoriet als placebo (vanwege de rode kleur), wordt veel gebruikt in
de sportwereld (men denkt ten onrechte dat B12 het lichaam meer energie
geeft en dat het kan bijdragen aan spierontwikkeling), en wordt toegepast
in producten als zonnebrandolie, mondverfrissers, tandplakverwijderaars,
anti-roos-middelen en anti-rimpelpreparaten.
7.3 De microbiologische productie van vitamine
B12
7.3.1 Micro-organismen en grondstoffen
In de jaren 50 was de productie van B12 nog geen zelfstandig industrieel
proces. De vitamine werd onttrokken aan vloeistoffen die overbleven van
andere fermentatieprocessen waarbij toevallig ook B12 werd geproduceerd.
Een van die fermentatieprocessen was de productie van antibiotica. Antibiotica
worden geproduceerd door een groep micro-organismen genaamd Streptomyceten.
Het medium bestond uit glucose en sojameel en de hoofdproducten waren streptomycis,
chloramphenicol en neomycine. De B12-opbrengst was ongeveer 1 mg per liter
medium. Ook werd B12 wel onttrokken aan brouwerij-afval en mest. De B12
die hiervan afkomstig was werd in ruwe en niet-volledig gezuiverde vorm
gebruikt in veevoer. Ook werd de B12 afkomstig van deze bron geheel zuiver
gemaakt zodat die geschikt was voor medisch gebruik, voor mensen. Een nadeel
van B12 uit mest is dat zich hierin grote hoeveelheden analogen bevinden
die niet eenvoudig (lees: niet goedkoop) van echte B12 zijn te scheiden.
Ondanks het feit dat B12 werd gewonnen als bijproduct van de grootschalige
antibioticaproductie (en andere fermentatieprocessen) kon al snel niet
meer aan de vraag naar B12 voldaan worden [Perlman
1978]. Er is toen veel onderzoek gedaan naar alternatieve productiemogelijkheden.
Doel was:
Er is veel onderzoek gedaan naar technieken om de vitamine uit het medium te isoleren en zuiver te maken. Het gaat immers om zeer kleine hoeveelheden, en welk medium of welke bacteriestam er ook wordt gebruikt, altijd worden er óók analogen gevormd.
Tegenwoordig zijn voor de productie van B12 aparte fermentatieprocessen
in gebruik met speciaal voor dit doel geselecteerde en gekweekte bacteriën.
De meest productieve bacteriestammen zijn mutanten. De mutaties kunnen
spontaan zijn opgetreden maar worden ook kunstmatig opgewekt door de bacterie
te bewerken met röntgenstralen of allerlei chemische stoffen. Ook
wordt gewerkt met recombinant-DNA technieken [Köhler
1985].
Van de honderden fermentatieprocessen waarvan bekend is dat er B12
wordt geproduceerd, worden er maar een stuk of 6 commercieel toegepast.
Enkele bacteriën met een relatief hoge opbrengst zijn: Bacillus
megaterium (0,45 mg per ml); Butylbacterium rettgeri (5 mg per
liter); Streptomyces olivaceus (3,3 mg per liter); Micromonospora
sp. (11,5 mg per liter); en Klebsiella pneumoniae (0,2 mg per
liter). De hoogste opbrengsten worden verkregen met Propionbacterium
freudenreichii (19 mg per liter); Propionbacterium shermanii
(23 mg per liter); en Pseudomonas denitrificans (60 mg per liter).
Pseudomonas en Propionbacterium groeien op melasse en
hebben de allerhoogste opbrengst. Deze twee soorten worden tegenwoordig
in de industrie het meest gebruikt. Het onderzoek staat echter niet stil.
Er wordt gewerkt aan micro-organismen die op goedkopere voedingsbodems
kunnen groeien, bijvoorbeeld op het afval van de voedingsmiddelenindustrie.
Met Methanobacterium op fruitafval wordt bijvoorbeeld een opbrengst
van 306 mg per kg bereikt. [Min 1990]. Ook wordt
geprobeerd B12 uit methanol te produceren. In dat opzicht zou Protaminobacter
ruber (220 microgram per liter) of Klebsiella (140 microgram
per liter) in de toekomst een belangrijke rol kunnen gaan spelen [Rehm
1980]. Ook wordt de productie van B12 uit alkanen onderzocht (aardgas
is een alkaan); in dat opzicht zou Corynebacterium simplex ( 0,6
mg per liter een rol kunnen gaan spelen [Rehm 1980].
Het aantal octrooi-aanvragen dat de laatste jaren voor deze nieuwe processen
wordt ingediend is groot.
7.3.2 De fermentatie met Propionbacterium freudenreichii
ATCC 6207 en Propionbacterium shermanii ATCC 13673 of hiervan afgeleide
stammen of mutanten [Ward 1989]; [Crueger
1984]
De fermentatie verloopt in twee fasen. In de eerste anaërobe fase
van twee dagen wordt voornamelijk een voorloper van B12, dimehylbenzimidazole
(DBI) geproduceerd, die in de tweede aërobe fase van vier dagen wordt
omgezet in B12, voornamelijk adenosylcobalamine. Er worden slechts zeer
kleine hoeveelheden analogen gevormd. De koolstofbron van de voedingsbodem
is glucose of omgezette melasse (10 - 100 gram per liter). Als stikstofbron
worden gistextracten en caseïne (het voornaamste eiwit in melk) gebruikt;
de laatste in een toevoeging van 1,2 procent [Rehm
1980]. De voorkeur gaat echter ook uit naar corn steep liquor (een
bijproduct van de zetmeelproductie uit maïs) omdat dit ook melkzuur
en pantotheenzuur (B5) bevat. Deze vitamine wordt echter ook wel los toegevoegd.
De productiviteit kan nog worden verhoogd door toevoeging van melksuiker
(een disaccharide in melk-dit wordt toegevoegd in een concentratie van
maximaal 40 gram per liter), en ook wordt wel gebruik gemaakt van wei [Marwaha
1984]. Daarnaast worden nog vele sporenelementen en minerale zouten
toegevoegd: ijzer-, mangaan-, kobalt- en magnesiumzouten. De koolstof-
en stikstofbronnen kunnen ook worden vervangen door afgeroomde melk. De
totale opbrengst zou 25 tot 40 mg per liter zijn na 6 dagen fermentatie.
Waarschijnlijk is de opbrengst nog hoger. In één patent [Ward
1989] wordt melding gemaakt van een opbrengst van 216 mg per liter.
7.3.3 Fermentatie met Pseudomonas [Ward
1989]; [Crueger 1984]
Van de Pseudomonas bacteriën is de Pseudomonas denitrificans
de meest productieve. Na twaalf jaar sleutelen aan deze bacterie zijn mutanten
ontwikkeld met een opbrengst van 60 mg per liter. Het productieproces met
deze bacterie is geheel aëroob. Aan het medium worden minder hoge
eisen gesteld en het kan veganistisch worden samengesteld: sucrose, gistextract,
en verschillende minerale zouten, waaronder kobaltnitraat. Ook moet dimehylbenzimidazole
(DBI-een stof die uit riboflavine (= vitamine B2) gesynthetiseerd wordt)
worden toegevoegd. Een gunstige werking heeft de toevoeging van betaïne,
een stof die gewonnen wordt uit suikerbieten [Demain
1968]. Deze stof bevordert de biosynthese van B12 en verhoogt de doorlaatbaarheid
van het celmembraan. Hierdoor kan de cel zijn of haar stofwisselingsproducten
gemakkelijker kwijt. Betaïne is bovendien een koolstofbron. Verder
moet nog choline worden toegevoegd. Dit kan zowel van plantaardige als
dierlijke oorsprong zijn.
7.4 Extractie van B12
Na de fermentatie moet de B12 uit het medium gehaald worden en worden
gezuiverd. Ondanks de vorderingen die op dat gebied zijn gemaakt blijft
het een moeizaam proces. Er bestaan meerdere methoden, bijvoorbeeld het
centrifugeren van het medium waardoor een soort crème van cellen
overblijft die gedroogd wordt en een B12-concentratie heeft van 385 mg
per kg en in ongezuiverde vorm in veevoeders gebruikt wordt (met propionibacterium
Perlman 1978]). Een andere methode is scheiding met behulp van ionenwisselaars,
waarna kristallisatie volgt. Ten behoeve van het extractieproces wordt
de gehele kweek op 80 tot 120 graden Celsius gebracht bij een pH van 6,5
tot 8,5. De cobalaminen worden eerst stabiel gemaakt door ze om te zetten
in cyano-, sulfiet-, sulfaat-, nitraat- of chloorcobalamine. Daarna volgt
extractie waarvoor meerdere technieken bestaan:
7.5 Productie van plantaardige B12-bevattende voedingsmiddelen
Omdat steeds meer mensen vegetarisch worden, wordt er aan de afdeling
Levensmiddelentechnologie en Gistingsprocessen van de Technische Universiteit
van Berlijn onderzoek gedaan naar het combineren van de bacteriële
productie van B12 met de (industriële) productie van voedingsmiddelen
als sojamelk en tofu [Bärwald 1991]. Onderdeel
van het onderzoek is het vinden van geschikte B12-producerende bacteriën
die in staat zijn om gedurende een (extra) ingelaste fermentatiefase in
het product B12 te produceren. Hierbij zijn verschillende dingen van belang:
de hoeveelheid B12 die door de bacterie wordt geproduceerd, de nevenproductie
van schadelijke stoffen die uiteraard achterwege dient te blijven, veranderingen
in smaak en consistentie veroorzaakt door het micro-organisme die tot een
minimum beperkt moeten blijven, en de inpasbaarheid in het productieproces
die voor een groot deel wordt bepaald door de fermentatieduur. De twee
bacteriën die zich voor de B12-productie in sojamelk het beste lijken
te lenen zijn Bacillus megaterium (ATTC 10778) en Propionibacterium
freudenreichii subspec. (ATTC 6207). De pseudomonaden zijn minder geschikt
omdat deze de melk al bij lage concentraties ( 106 bacteriën/ml) onprettig
doen ruiken en smaken. B. Megaterium veroorzaakt in de melk een
kazige lucht en kan ook door het vormen van zuren tot klontering van de
melk leiden. De fermentatie duurt 24 uur bij 30 graden Celsius, en er is
dan een B12-concentratie van 5,2 microgram per 100 gram bereikt.
Ook Propionibacterium freudenreichii subspec. veroorzaakt een
kazige lucht (als van emmentalerkaas). De productie van B12 met deze bacterie
is nogal bewerkelijk omdat de fermentatie in 2 fasen van ieder 72 uur moet
worden uitgevoerd. Er kan echter een B12-concentratie van 45,3 microgram
per 100 gram worden bereikt.
De bacteriën worden geënt nadat de sojamelk is gepasteuriseerd;
de fermentatie wordt afgebroken door de sojamelk te steriliseren. De B12-productie
kan worden opgevoerd door kobalt toe te voegen. Na toevoeging van kobalt
in een concentratie van 1,24 ppm loopt de B12-concentratie bij B. megaterium
op van 5,2 naar 13,5 microgram per 100 gram en bij Propionibacterium
freudenreichii subspec. van 45,3 naar 80 microgram per 100 gram. Bovendien
kan door toevoegen van kobalt bij Propionibacterium freudenreichii
subspec. de fermentatieduur bekort worden. De B12-productie met
B. megaterium kan nog worden gestimuleerd door het toevoegen van verteerbare
koolhydraten.
Het maken van tofu van sojamelk die op bovenstaande wijze met B12 is
verrijkt kan problemen geven. De eiwitten ondergaan tijdens de fermentatie
een verandering waardoor de tofu zacht blijft. Door de duur van de fermentatie
te bekorten is hier echter iets aan te doen. Twintig procent van de B12
gaat bij het maken van tofu verloren in het spoelwater. Tachtig procent
van de B12 blijft gebonden aan de eiwitten en blijft in de tofu.
Om het eindproduct het gewenste B12-gehalte te geven kan B12-bevattende
sojamelk worden vermengd met B12-loze sojamelk. In Nederland is het verboden
om B12 aan voedingsmiddelen toe te voegen. Door bovenstaande ontwikkeling
wordt het misschien mogelijk om toch B12-bevattende sojamelk in de winkels
te krijgen. Helaas bevindt de ontwikkeling zich nog in een experimentele
fase. Het fermentatieproces van tempeh duurt veel korter dan het fermentatieproces
bij de productie van B12 met bovenstaande bacteriën. Onder andere
hierdoor zijn bovenstaande technieken ongeschikt voor het verrijken van
tempeh met B12 [Bärwald 1991].